應(yīng)用背景

酵母表達(dá)系統(tǒng)分為釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)和甲醇營養(yǎng)性酵母表達(dá)系統(tǒng)，后者（如畢赤酵母）是目前應(yīng)用廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。酵母表達(dá)系統(tǒng)是工業(yè)微生物中應(yīng)用較廣泛的系統(tǒng)。酵母表達(dá)系統(tǒng)兼有原核和高等真核系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，既有原核表達(dá)的周期短、成本低、易操作，適合工業(yè)級別放大培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)；同時具備了真核細(xì)胞對蛋白的糖基化修飾，空間折疊等能力，使得蛋白折疊保真性和可溶性都大幅度提高，是重組蛋白表達(dá)的強(qiáng)有力工具。

應(yīng)用難點(diǎn)

胞內(nèi)表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)量高，糖基化程度很低或無糖基化，胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白具有良好的活性和生物安全性，但是胞內(nèi)表達(dá)需要對細(xì)胞進(jìn)行破碎才可以收集產(chǎn)物，由于畢赤酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁按結(jié)構(gòu)劃分為可分為三層，最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀；上面的是一層糖蛋白；最外層是甘露聚糖，由1，6-磷酸二酯鍵連接成網(wǎng)狀。在該層的內(nèi)部，有甘露聚糖-酶的復(fù)合物。破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。

應(yīng)用案例

畢赤酵母體系是真核體系中操作簡單、成本低廉的系統(tǒng)，在蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等方面具有諸多優(yōu)勢，在畢赤酵母體系中蛋白轉(zhuǎn)錄后糖基化所增加的寡糖鏈長度（平均每個支鏈8-14 個甘露糖殘基）非常接近高等真核生物的結(jié)構(gòu)，活性幾率大大高于原核體系。與其他表達(dá)系統(tǒng)的基因存在于游離質(zhì)粒上不同，它的表達(dá)質(zhì)粒是通過同源重組整合在基因組上的，轉(zhuǎn)化簡單（不需要病毒原液），表達(dá)菌株可以長時間保持（大于10年）而不失活。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，具有使用簡單、表達(dá)量高、可大規(guī)模生產(chǎn)、相對低廉的價格、有很多真核的翻譯后修飾和加工、大蛋白能較好地折疊等特點(diǎn)。適合于穩(wěn)定表達(dá)有功能的外源蛋白質(zhì)，而且可大規(guī)模發(fā)酵，是理想的重組真核蛋白生產(chǎn)制備工具。畢赤酵母，一種具有高表達(dá)能力和穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，是目前僅次于大腸桿菌的常見的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室及生產(chǎn)規(guī)模蛋白質(zhì)制備、表征以及結(jié)構(gòu)解析等方面。它具有高效、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)表達(dá)性能，能夠抵御各種逆境，并且在發(fā)酵過程中不需要使用抗生素。這些特點(diǎn)使得畢赤酵母成為了一種重要的生物表達(dá)系統(tǒng)，為科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)提供了無限可能。

應(yīng)用方案

通過高壓細(xì)胞破碎儀使物料在柱塞作用下進(jìn)入可調(diào)節(jié)壓力大小的閥組中經(jīng)過特定寬度的限流縫隙均質(zhì)區(qū)在均質(zhì)閥內(nèi)產(chǎn)生三種效應(yīng):空穴效應(yīng)、撞擊效應(yīng)、剪切效應(yīng)的機(jī)械作用力從而打破細(xì)胞壁的束縛，把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來盡可能保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性，達(dá)到高效率破碎細(xì)胞的效果。即使用高壓勻漿破碎法采用高壓細(xì)胞破碎法，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的壓力效應(yīng)，從而能夠有效地提取出蛋白質(zhì)，且處理量大、破碎速度較快。這是一種機(jī)械處理細(xì)胞，物理抽提方法。

解決方案

首先富集菌體，收集胞內(nèi)產(chǎn)物的細(xì)胞或菌體。然后進(jìn)行細(xì)胞重懸，用適當(dāng)?shù)木彌_液或培養(yǎng)液將離心或沉降等方法得到的固體（沉淀、細(xì)胞、活性物質(zhì)等等）重新懸浮。其次進(jìn)行細(xì)胞破碎，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相中。最后收集含生化物質(zhì)的液相，進(jìn)行碎片分離，分離除去細(xì)胞、菌體、細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)的沉淀物和絮凝體等固體懸浮物，得到上清液或?yàn)V液。然后從澄清的濾液中提取胞內(nèi)產(chǎn)物，從細(xì)胞裂解物中獲取目標(biāo)產(chǎn)物。

PhD優(yōu)勢

高壓均質(zhì)使酵母細(xì)胞破壁，酵母中更多的自溶物就更容易的釋放到水環(huán)境中，進(jìn)一步的抽提量也就增加。高壓均質(zhì)處理后酵母細(xì)胞壁破損使胞內(nèi)物不再受細(xì)胞壁的限制，酶和底物的反應(yīng)空間更加充足，反應(yīng)產(chǎn)物的抑制作用減小，既增大了酶的活性，又保持酶的活力，還加快反應(yīng)速度。高壓細(xì)胞破碎儀可以從酵母或細(xì)菌中提取酶、蛋白質(zhì)等細(xì)胞物質(zhì)，不使用溶劑或化學(xué)物質(zhì)破碎細(xì)胞壁。酵母菌一般需要1300bar的壓力破碎3-4遍，破碎率可以達(dá)到 90%以上，常見的典型應(yīng)用：HPV疫苗、諾如病毒疫苗、乙肝疫苗、手足口病疫苗等。

◆破壁能力：高壓設(shè)計，輕松上壓；均質(zhì)效率高，工藝穩(wěn)定；穩(wěn)定的破碎能力，更高的胞內(nèi)物提取；純機(jī)械破碎，無化學(xué)污染；可放大工業(yè)化生產(chǎn)工藝設(shè)備

◆控溫效果：獨(dú)特溫控設(shè)計，內(nèi)置和外置雙向控溫，確保均質(zhì)過程及出料溫度可控。

◆活性保障：循環(huán)的控溫系統(tǒng)，蛋白活性不失活，細(xì)胞破碎后，活性保值高達(dá)99%                                                                 

◆無菌保障：金屬結(jié)構(gòu)連接，沒有O型圈或墊片，無死角設(shè)計；在線排空結(jié)構(gòu)設(shè)計；所有機(jī)型均可實(shí)現(xiàn)在線清洗（CIP）、循環(huán)清洗、拆裝清洗、在位滅菌（SIP）