CHO細胞

CHO細胞是中國倉鼠卵巢細胞，1957年美國科羅拉多大學Dr.Theodore T.Puck從一成年雌性倉鼠卵巢分離獲得，是生物工程上廣泛使用的細胞系。分子生物學、分子免疫學等學科的發(fā)展使基因工程具有越來越重要的地位。在基因工程研究的動物細胞表達系統(tǒng)中，最具代表性的就是中國倉鼠卵巢細胞(ChineseHamster Ovary,CHO)。它是用來表達外源蛋白最多也最成功的一類細胞。

CHO細胞表達體系

CHO細胞屬于成纖維細胞，屬于成纖維細胞，可貼壁培養(yǎng)，經(jīng)多次傳代篩選后也可懸浮培養(yǎng)。CHO細胞是一種非分泌細胞，本身很少分泌內(nèi)源蛋白，因此對目標蛋白分離純化十分有利；形成有活性二聚體，具有糖基化功能，是表達復(fù)雜生物大分子的理想宿主；具有不死性，可傳百代以上，是生物工程廣泛使用的細胞系。CHO細胞培養(yǎng)可在人工控制條件的生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)；比微生物細胞更大，無細胞壁，機械強度較低，對剪切力敏感，環(huán)境適應(yīng)能力差；配增時間長，生長緩慢，易受微生物污染；培養(yǎng)過程中細胞相互粘連以集群形式存在培養(yǎng)過程需氧量少，代謝產(chǎn)物具有生物活性，生產(chǎn)成本高。

重組蛋白

基因工程藥物研發(fā)的主要環(huán)節(jié)有基因的克隆和基因工程菌的構(gòu)造、重組細胞的培養(yǎng)、目的產(chǎn)物的分離純化等。針對這些主要環(huán)節(jié)，研究人員正致力于高效表達、培養(yǎng)工藝及下游分離純化等方面的研究。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，目前已有多種表達系統(tǒng)可用于生產(chǎn)具有醫(yī)療價值的人或動物來源的蛋白質(zhì)。大腸桿菌(E.coli)是使用最早的表達系統(tǒng)，其顯著優(yōu)點是易于操作，產(chǎn)量高，成本低。但由于用E.coli生產(chǎn)的蛋白質(zhì)藥物因缺乏糖基化而在人體內(nèi)易被降解，因此它的藥放大大降低。此外，它還存在易產(chǎn)生內(nèi)毒素和包涵體的問題。真核細胞中CHO細胞是目前重組糖基蛋白生產(chǎn)的首選體系；因為與其他表達系統(tǒng)相比，它具有許多優(yōu)點：①具有準確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達的蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學功能方面最接近于天然蛋白分子。②具具有產(chǎn)物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，便于下游產(chǎn)物分離純化。③具有重組基因的高效擴增和表達能力，外源蛋白的整合穩(wěn)定。④具有貼壁生長特性，且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，可以進行懸浮培養(yǎng)，表達水平較高。⑤CHO細胞屬于成纖維細胞(fibroblast),很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的啟分離。⑥能以懸浮培養(yǎng)方式或在無血清培養(yǎng)基中達到高密度培養(yǎng)。且培養(yǎng)體積能達到1000L以上，可以大規(guī)模生產(chǎn)。

應(yīng)用方案

通過高壓細胞破碎儀使物料在柱塞作用下進入可調(diào)節(jié)壓力大小的閥組中經(jīng)過特定寬度的限流縫隙均質(zhì)區(qū)在均質(zhì)閥內(nèi)產(chǎn)生三種效應(yīng):空穴效應(yīng)、撞擊效應(yīng)、剪切效應(yīng)的機械作用力從而打破細胞壁的束縛，把蛋白質(zhì)從組織或細胞中釋放出來盡可能保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性，達到高效率破碎細胞的效果。即使用高壓勻漿破碎法采用高壓細胞破碎法，在細胞內(nèi)產(chǎn)生的壓力效應(yīng)，從而能夠有效地提取出蛋白質(zhì)，且處理量大、破碎速度較快。這是一種機械處理細胞，物理抽提方法。

解決方案

首先富集菌體，收集胞內(nèi)產(chǎn)物的細胞或菌體。然后進行細胞重懸，用適當?shù)木彌_液或培養(yǎng)液將離心或沉降等方法得到的固體（沉淀、細胞、活性物質(zhì)等等）重新懸浮。其次進行細胞破碎，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相中。最后收集含生化物質(zhì)的液相，進行碎片分離，分離除去細胞、菌體、細胞碎片、蛋白質(zhì)的沉淀物和絮凝體等固體懸浮物，得到上清液或濾液。然后從澄清的濾液中提取胞內(nèi)產(chǎn)物，從細胞裂解物中獲取目標產(chǎn)物。

PHD優(yōu)勢

重組人粒細胞刺激因子（CHO細胞）系由高效表達人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)基因的大腸桿菌，利用基因重組技術(shù)經(jīng)發(fā)酵、分離和高度純化后制成。與天然產(chǎn)品相比，生物活性在體內(nèi)、外基本一致。G-CSF是調(diào)節(jié)骨髓中粒系造血的主要細胞因子之一，可選擇性地作用于粒系造血祖細胞，促進其增殖、分化，并可增加粒系終末分化細胞即外周血中性粒細胞的數(shù)目與功能。

◆破壁能力：高壓設(shè)計，輕松上壓；均質(zhì)效率高，工藝穩(wěn)定；穩(wěn)定的破碎能力，更高的胞內(nèi)物提取；純機械破碎，無化學污染；可放大工業(yè)化生產(chǎn)工藝設(shè)備

◆控溫效果：獨特溫控設(shè)計，內(nèi)置和外置雙向控溫，確保均質(zhì)過程及出料溫度可控。

◆活性保障：循環(huán)的控溫系統(tǒng)，蛋白活性不失活，細胞破碎后，活性保值高達99%                                                                 

◆無菌保障：金屬結(jié)構(gòu)連接，沒有O型圈或墊片，無死角設(shè)計；在線排空結(jié)構(gòu)設(shè)計；所有機型均可實現(xiàn)在線清洗（CIP）、循環(huán)清洗、拆裝清洗、在位滅菌（SIP）