腫瘤壞死因子（TNF）

1975年，Carswell等發現并命名了TNF:先用細菌內毒素處理小鼠，而后在小鼠的血清中發現一種物質會導致腫瘤壞死，并將其稱為腫瘤壞死因子。1984年，Pennica等首先對人TNF-a的cDNA進行了成功克隆，并在大腸桿菌中得到了表達。1985年，Shalaby把腫瘤壞死因子分為TNF-α和TNF-β。腫瘤壞死因子( Tumor Necrosis Factor,TNF)是一種的具有抗腫瘤活性的細胞因子，具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調節等多種生物活性。

大腸桿菌表達系統

原核表達系統是基因表達技術中發展最早，應用最廣泛的蛋白表達系統之一。近幾十年，大腸桿菌表達系統也不斷得到發展和完善，被科研及工業用戶大量用于各種重組蛋白表達。市面上的重組蛋白有30%是由大腸桿菌表達系統生產而來，是小分子細胞質蛋白或結構域表達的首選宿主。在大腸桿菌表達系統中表達的外源基因包括原核基因和真核基因；原核基因可以直接在大腸桿菌中表達出來，真核基因含有內含子，大腸桿菌不能對mRNA進行剪切形成成熟的mRNA，因此，真核基因一般以cDNA構建表達載體在大腸桿菌系統中表達。

應用方案

通過高壓細胞破碎儀使物料在柱塞作用下進入可調節壓力大小的閥組中經過特定寬度的限流縫隙均質區在均質閥內產生三種效應:空穴效應、撞擊效應、剪切效應的機械作用力從而打破細胞壁的束縛，把蛋白質從組織或細胞中釋放出來盡可能保持原來的天然狀態，不喪失活性，達到高效率破碎細胞的效果。即使用高壓勻漿破碎法采用高壓細胞破碎法，在細胞內產生的壓力效應，從而能夠有效地提取出蛋白質，且處理量大、破碎速度較快。這是一種機械處理細胞，物理抽提方法。

解決方案

首先富集菌體，收集胞內產物的細胞或菌體。然后進行細胞重懸，用適當的緩沖液或培養液將離心或沉降等方法得到的固體（沉淀、細胞、活性物質等等）重新懸浮。其次進行細胞破碎，使產物轉移到液相中。最后收集含生化物質的液相，進行碎片分離，分離除去細胞、菌體、細胞碎片、蛋白質的沉淀物和絮凝體等固體懸浮物，得到上清液或濾液。然后從澄清的濾液中提取胞內產物，從細胞裂解物中獲取目標產物。

1、發酵罐培養：根據rmh-TNF的表達，使用單因素法對由rmh-TNF在大腸桿菌中表達時的誘導時機、誘導維持時間、pH值、溶解氧等進行了研究，選擇出較好的發酵工藝參數。根據rmh-TNF代謝特點，通過對補料工藝的研究，確定了注射用重組改構人腫瘤壞死因子發酵罐發酵開始誘導后高溫滅菌的補料培養基以流加的方式對發酵罐進行補加的新補料工藝。

2、發酵液離心：用高速離心的方法收集菌體，將放罐接口與管式分離機進液口連接，開啟管式分離機冷凍水的供水閥門，開啟管式分離機(16000 rpm),控制發酵液流速1.0-1.5L/min離心，上清液經專用管道排至自動滅活罐滅活后排棄。離心完畢后取出菌體。

3、菌體洗滌：將菌體混懸于TES溶液中，緩緩攪拌洗滌，用高速冷凍離心機，在4℃下，8000 rpm,離心20分鐘。重復洗滌操作一次。濕菌體稱重，-20℃冰箱保存。

4、菌體破碎：將菌體混懸，調節高壓勻漿機泵馬達進氣閥門和出料管進氣閥門使流出管壓力在5000-20000 Psi范圍內對菌體進行勻漿破碎得到細胞破碎液。

PhD優勢

工程大腸桿菌HMS174菌種的全面檢定，確認該重組菌rmh-TNF工程菌構建正確，目的蛋白占菌體總蛋白的百分含量大于30%，菌種保持穩定，菌種穩定性好，呈短棒狀，無芽孢、支原體等微生物污染，革蘭染色及生化檢定呈典型的大腸桿菌特征，該菌適用于工程菌菌種庫。

◆破壁能力：高壓設計，輕松上壓；均質效率高，工藝穩定；穩定的破碎能力，更高的胞內物提取；純機械破碎，無化學污染；可放大工業化生產工藝設備

◆控溫效果：獨特溫控設計，內置和外置雙向控溫，確保均質過程及出料溫度可控。

◆活性保障：循環的控溫系統，蛋白活性不失活，細胞破碎后，活性保值高達99%                                                                 

◆無菌保障：金屬結構連接，沒有O型圈或墊片，無死角設計；在線排空結構設計；所有機型均可實現在線清洗（CIP）、循環清洗、拆裝清洗、在位滅菌（SIP）