PhD細(xì)胞破壁機(jī)-畢赤酵母破壁

應(yīng)用背景

       畢赤酵母體系是真核體系中操作簡單、成本低廉的系統(tǒng)，在蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等方面具有諸多優(yōu)勢，在畢赤酵母體系中蛋白轉(zhuǎn)錄后糖基化所增加的寡糖鏈長度（平均每個支鏈8-14 個甘露糖殘基）非常接近高等真核生物的結(jié)構(gòu)，活性幾率大大高于原核體系。與其他表達(dá)系統(tǒng)的基因存在于游離質(zhì)粒上不同，它的表達(dá)質(zhì)粒是通過同源重組整合在基因組上的，轉(zhuǎn)化簡單（不需要病毒原液），表達(dá)菌株可以長時間保持（大于10年）而不失活。

應(yīng)用難點(diǎn)

       胞內(nèi)表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)量高，糖基化程度很低或無糖基化，胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白具有良好的活性和生物安全性，但是胞內(nèi)表達(dá)需要對細(xì)胞進(jìn)行破碎才可以收集產(chǎn)物，由于畢赤酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁按結(jié)構(gòu)劃分為可分為三層，最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀；上面的是一層糖蛋白；最外層是甘露聚糖，由1，6-磷酸二酯鍵連接成網(wǎng)狀。在該層的內(nèi)部，有甘露聚糖-酶的復(fù)合物。破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。

應(yīng)用方案

       通過高壓細(xì)胞破碎儀使物料在柱塞作用下進(jìn)入可調(diào)節(jié)壓力大小的閥組中經(jīng)過特定寬度的限流縫隙均質(zhì)區(qū)在均質(zhì)閥內(nèi)產(chǎn)生三種效應(yīng):空穴效應(yīng)、撞擊效應(yīng)、剪切效應(yīng)的機(jī)械作用力從而打破細(xì)胞壁的束縛，把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來盡可能保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性，達(dá)到高效率破碎細(xì)胞的效果。即使用高壓勻漿破碎法采用高壓細(xì)胞破碎法，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的壓力效應(yīng)，從而能夠有效地提取出蛋白質(zhì)，且處理量大、破碎速度較快。這是一種機(jī)械處理細(xì)胞，物理抽提方法。

解決方案

       首先富集菌體，收集胞內(nèi)產(chǎn)物的細(xì)胞或菌體。然后進(jìn)行細(xì)胞重懸，用適當(dāng)?shù)木彌_液或培養(yǎng)液將離心或沉降等方法得到的固體（沉淀、細(xì)胞、活性物質(zhì)等等）重新懸浮。其次進(jìn)行細(xì)胞破碎，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相中。最后收集含生化物質(zhì)的液相，進(jìn)行碎片分離，分離除去細(xì)胞、菌體、細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)的沉淀物和絮凝體等固體懸浮物，得到上清液或?yàn)V液。然后從澄清的濾液中提取胞內(nèi)產(chǎn)物，從細(xì)胞裂解物中獲取目標(biāo)產(chǎn)物。

應(yīng)用效果

       高壓均質(zhì)使酵母細(xì)胞破壁，酵母中更多的自溶物就更容易的釋放到水環(huán)境中，進(jìn)一步的抽提量也就增加。高壓均質(zhì)處理后酵母細(xì)胞壁破損使胞內(nèi)物不再受細(xì)胞壁的限制，酶和底物的反應(yīng)空間更加充足，反應(yīng)產(chǎn)物的抑制作用減小，既增大了酶的活性，又保持酶的活力，還加快反應(yīng)速度。酵母菌一般需要1300bar的壓力破碎3-4遍，破碎率可以達(dá)到 90%以上，常見的典型應(yīng)用：HPV疫苗、諾如病毒疫苗、乙肝疫苗、手足口病疫苗等。

技術(shù)工藝

破壁工藝：PhD高壓均質(zhì)處理

溫控要求：10℃以內(nèi)

破壁難點(diǎn)：菌濃較高，此菌液破壁條件未知

破壁結(jié)果：破壁得率客戶認(rèn)可