PhD細胞破壁機-畢赤酵母破壁

應用背景

       畢赤酵母體系是真核體系中操作簡單、成本低廉的系統，在蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等方面具有諸多優勢，在畢赤酵母體系中蛋白轉錄后糖基化所增加的寡糖鏈長度（平均每個支鏈8-14 個甘露糖殘基）非常接近高等真核生物的結構，活性幾率大大高于原核體系。與其他表達系統的基因存在于游離質粒上不同，它的表達質粒是通過同源重組整合在基因組上的，轉化簡單（不需要病毒原液），表達菌株可以長時間保持（大于10年）而不失活。

應用難點

       胞內表達的優點是表達量高，糖基化程度很低或無糖基化，胞內表達的重組蛋白具有良好的活性和生物安全性，但是胞內表達需要對細胞進行破碎才可以收集產物，由于畢赤酵母細胞的細胞壁按結構劃分為可分為三層，最里層是由葡聚糖的細纖維組成，它構成了細胞壁的剛性骨架，使細胞具有一定的形狀；上面的是一層糖蛋白；最外層是甘露聚糖，由1，6-磷酸二酯鍵連接成網狀。在該層的內部，有甘露聚糖-酶的復合物。破碎酵母細胞壁的阻力主要決定于壁結構交聯的緊密程度和它的厚度。

應用方案

       通過高壓細胞破碎儀使物料在柱塞作用下進入可調節壓力大小的閥組中經過特定寬度的限流縫隙均質區在均質閥內產生三種效應:空穴效應、撞擊效應、剪切效應的機械作用力從而打破細胞壁的束縛，把蛋白質從組織或細胞中釋放出來盡可能保持原來的天然狀態，不喪失活性，達到高效率破碎細胞的效果。即使用高壓勻漿破碎法采用高壓細胞破碎法，在細胞內產生的壓力效應，從而能夠有效地提取出蛋白質，且處理量大、破碎速度較快。這是一種機械處理細胞，物理抽提方法。

解決方案

       首先富集菌體，收集胞內產物的細胞或菌體。然后進行細胞重懸，用適當的緩沖液或培養液將離心或沉降等方法得到的固體（沉淀、細胞、活性物質等等）重新懸浮。其次進行細胞破碎，使產物轉移到液相中。最后收集含生化物質的液相，進行碎片分離，分離除去細胞、菌體、細胞碎片、蛋白質的沉淀物和絮凝體等固體懸浮物，得到上清液或濾液。然后從澄清的濾液中提取胞內產物，從細胞裂解物中獲取目標產物。

應用效果

       高壓均質使酵母細胞破壁，酵母中更多的自溶物就更容易的釋放到水環境中，進一步的抽提量也就增加。高壓均質處理后酵母細胞壁破損使胞內物不再受細胞壁的限制，酶和底物的反應空間更加充足，反應產物的抑制作用減小，既增大了酶的活性，又保持酶的活力，還加快反應速度。酵母菌一般需要1300bar的壓力破碎3-4遍，破碎率可以達到 90%以上，常見的典型應用：HPV疫苗、諾如病毒疫苗、乙肝疫苗、手足口病疫苗等。

技術工藝

破壁工藝：PhD高壓均質處理

溫控要求：10℃以內

破壁難點：菌濃較高，此菌液破壁條件未知

破壁結果：破壁得率客戶認可