PhD細胞破壁機-昆蟲細胞

應(yīng)用背景

又稱昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)（Baculovirus expression vector system，BEVS），屬于真核細胞表達系統(tǒng)，更接近哺乳動物細胞的表達系統(tǒng)，但不同于酵母和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。昆蟲表達系統(tǒng)憑借其穩(wěn)定的實驗體系、高表達水平及翻譯后修飾功能而被普遍認可為一種表達大規(guī)模蛋白的強有力的工具,可以提供高活性的重組蛋白，解決在其它體系中無法解決的蛋白活性困難。昆蟲表達系統(tǒng)由于其具有高效的表達能力，通過BEVS得到的重組病毒易于篩選、具有翻譯后修飾功能、表達外源基因的效率較高。BEVS還可以同時表達多個外源基因，在分泌蛋白生物活性的同時增加產(chǎn)量。因此，BEVS在科研和工業(yè)生產(chǎn)中通常應(yīng)用于大規(guī)模重組蛋白的制備。應(yīng)用的菌株有sf9、sf21、High-5等。

重組蛋白

通過轉(zhuǎn)座作用將轉(zhuǎn)移載體中的表達組件定點轉(zhuǎn)座到能在大腸桿菌中繁殖的桿狀病毒穿梭載體上，通過抗性和藍白斑篩選到重組穿梭質(zhì)粒，提取穿梭質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細胞后，得到的子代病毒即為重組病毒。將病毒上清浸染昆蟲細胞，獲得表達的重組蛋白。

應(yīng)用優(yōu)勢

大蛋白正確折疊、具有真核翻譯后修飾、毒性蛋白可被表達。適用于病毒疫苗、信號分子、細胞因子、激酶等。用于生產(chǎn)具有哺乳動物細胞末端唾液酸化修飾的N糖蛋白。

應(yīng)用方案

通過高壓細胞破碎儀使物料在柱塞作用下進入可調(diào)節(jié)壓力大小的閥組中經(jīng)過特定寬度的限流縫隙均質(zhì)區(qū)在均質(zhì)閥內(nèi)產(chǎn)生三種效應(yīng):空穴效應(yīng)、撞擊效應(yīng)、剪切效應(yīng)的機械作用力從而打破細胞壁的束縛，把蛋白質(zhì)從組織或細胞中釋放出來盡可能保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性，達到高效率破碎細胞的效果。即使用高壓勻漿破碎法采用高壓細胞破碎法，在細胞內(nèi)產(chǎn)生的壓力效應(yīng)，從而能夠有效地提取出蛋白質(zhì)，且處理量大、破碎速度較快。這是一種機械處理細胞，物理抽提方法。

解決方案

首先富集菌體，收集胞內(nèi)產(chǎn)物的細胞或菌體。然后進行細胞重懸，用適當(dāng)?shù)木彌_液或培養(yǎng)液將離心或沉降等方法得到的固體（沉淀、細胞、活性物質(zhì)等等）重新懸浮。其次進行細胞破碎，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相中。最后收集含生化物質(zhì)的液相，進行碎片分離，分離除去細胞、菌體、細胞碎片、蛋白質(zhì)的沉淀物和絮凝體等固體懸浮物，得到上清液或濾液。然后從澄清的濾液中提取胞內(nèi)產(chǎn)物，從細胞裂解物中獲取目標(biāo)產(chǎn)物。

技術(shù)優(yōu)勢

均質(zhì)閥體終身保修                                                                                                                                                                

密封無O型圈或墊片，金屬結(jié)構(gòu)連接                                                                                                                                                  

細胞破碎率≥97%                                                                                                                                

內(nèi)置和外置雙向控溫                                                                                                                                           

所有機型均可實現(xiàn)SIP和CIP

HMI系統(tǒng)，工控自動化

高效細胞破碎率

減少破碎次數(shù)要求

滿足多種細胞破碎要求

更高的蛋白質(zhì)獲得率

穩(wěn)定的破碎能力

微通道高壓型結(jié)構(gòu)導(dǎo)致極佳的效果重現(xiàn)性

微通道高壓型結(jié)構(gòu)可線性放大研發(fā)工藝結(jié)果

技術(shù)工藝

破壁工藝：PhD高壓均質(zhì)處理

溫控要求：10℃以內(nèi)

破壁難點：菌濃較高，此菌液破壁條件未知

破壁結(jié)果：破壁率獲得用戶認可